AVALIAÇÃO DE SINAIS CLÍNICOS E QUANTIFICAÇÃO DE CARGA PARASITÁRIA EM CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum ATRAVÉS DO DESENVOLVIMENTO DE PCR EM TEMPO REAL (qPCR) E PCR DIGITAL (dPCR)
Leishmania, PCR Digital, Cães
As Leishmanioses são enfermidades zoonóticas, com grande distribuição mundial sendo endêmica em vários países do mundo. Estão entre as seis doenças endêmicas consideradas prioritárias segundo a Organização Mundial de Saúde. A estimativa é que a incidência anual seja de cerca de 2 milhões de casos, destes aproximadamente 1,5 milhões causados por formas tegumentares da doença e 500 mil relacionados a forma visceral (WHO 2015). Nas Américas, o agente causador da forma visceral, são os protozoários da espécie Leishmania (Leishmania) infantum e a transmissão ao hospedeiro ou reservatório vertebrado, ocorre através da picada de dípteros da espécie Lutzomyia longipalpis (OPAS 2015). Descrita inicialmente como uma doença de âmbito rural, a LV vem apresentando uma mudança no perfil epidemiológico. O aumento dos casos em grandes cidades do país, demonstram a urbanização da Leishmaniose Visceral. Em Minas Gerais esta urbanização já foi demonstrada em cidades como Belo Horizonte, Montes Claros e Governador Valadares. Neste contexto, entre outros fatores, o cão aparece como um dos responsáveis por essa urbanização, uma vez que este animal é considerado o principal reservatório doméstico da LV (Silva et al., 2001; MS 2006) sendo assim, o principal elo da transmissão de Leishmania (L.) infantum aos seres humanos. A relação epidemiológica da infecção de cães e humanos por Leishmania infantum gera uma necessidade de estudo constante da relação entre o parasita e o hospedeiro canino, inclusive com o desenvolvimento de métodos e testes que permitam detectar e também quantificar a carga parasitária. Uma das características importantes desta doença é a forma assintomática em alguns cães. Estes animais representam um grande problema para a saúde pública, uma vez que, a ausência de sinais clínicos dificulta a identificação da doença e impossibilita a adoção de medidas eficazes no controle da LV (MACHADO 2007). Devido à dificuldade do diagnóstico clínico da doença em cães assintomáticos, é importante que testes laboratoriais sejam empregados na identificação de animais infectados com LVC. Atualmente, os métodos mais conhecidos e utilizados na identificação de cães doentes são os diagnósticos clínicos, parasitológicos, sorológicos e moleculares (Dotta SCN, LOT RFE & Zappa V, 2009). Atualmente o Ministério da Saúde recomenda o uso do teste TR DPP® em inquéritos sorológicos para a triagem de cães e o material biológico dos animais reagentes ao TR DPP® é submetido ao teste ELISA para confirmar a
infecção por LVC. Além dos testes laboratoriais utilizados para diagnóstico ou estudo na evolução da doença em cães, as técnicas moleculares passaram a fazer parte do aparato de diagnóstico da LV. Tanto a PCR convencional (cPCR) quando a PCR em tempo real (qPCR) podem ser utilizadas no diagnóstico. A qPCR tem a vantagem da sensibilidade, velocidade e diminuição da possibilidade de contaminação, no entanto com um custo ainda mais elevado. A PCR digital é outra ferramenta útil para diagnóstico e pesquisa de L. infantum. A diferença das outras metodologias é a partição da amostra de modo que a amplificação ocorra separadamente de modo que, dentro de um tubo ou chip, o material genético seja amplificado a partir de moléculas únicas. A Leishmaniose Visceral é uma doença em franca expansão, sendo considerada a forma mais grave entre os tipos desta doença especialmente em casos humanos não tratados, pois pode alcançar altas taxas de mortalidade. Portanto é cada vez mais necessário o estudo de técnicas que possam auxiliar no diagnóstico e entendimento desta doença, em especial em seus reservatórios domésticos. A compreensão da carga parasitária e sua relação com os sinais clínicos apresentados por cães naturalmente infectados por LVC pode ajudar no desenvolvimento de pesquisas e tratamentos para cães de modo a reduzir a transmissão da doença. Nesse estudo trinta e nove amostras clínicas de baço de cães foram coletadas após necropsia de animais confirmados como positivos. Todas as amostras foram analisadas através dos testes sorológicos (DPP® e ELISA), parasitológico e PCR convencional para determinar a espécie de leishmania. Duas ferramentas moleculares foram utilizadas para quantificação da carga parasitária de Leishmania infatum em cães neste experimento a qPCR e a ddPCR. As ferramentas desenvolvidas neste trabalho são importantes para a pesquisa de L. infantum em seres humanos ou em cães. Estudos sobre o curso da enfermidade continuam sendo importantes para elucidar os mecanismos de interação entre hospedeiro e parasita, assim como avaliar o funcionamento de tratamentos e vacinas. A PCR digital, por não necessitar de curva padrão e por ter fácil padronização, é uma nova ferramenta que pode gerar informações ainda mais aprofundadas no amplo debate sobre as cargas parasitárias e a patogenia da leishmaniose.