Triagem, seleção e avaliação biológica de epítopos para o diagnóstico sorológico de hepatite delta e doença de Chagas

Doença de Chagas, hepatite delta, imunodiagnóstico, docking molecular, peptídeos

A doença de Chagas (DC) e a hepatite delta são doenças graves e que acometem principalmente países de baixa renda. A DC é uma doença negligenciada causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. Segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de 6 a 7 milhões de pessoas estão infectadas pelo T. cruzi, mas apenas 10% são diagnosticados. As manifestações clínicas da DC são divididas em duas fases, aguda e crônica. Na fase crônica, os métodos diagnósticos apresentam limitações, sendo necessário o uso de dois ou mais testes sorológicos, uma vez que ainda não existe um teste padrão-ouro validado para essa fase. Além disso, no Brasil, os testes sorológicos utilizam antígenos recombinantes importados, elevando o custo do teste. Já a hepatite delta é causada pelo vírus da hepatite delta (HDV), que é conhecido como vírus satélite pois necessita do vírus da

hepatite B (HBV) para sua entrada nos hepatócitos, expressão e replicação. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 12 milhões de indivíduos estão infectados com HDV, equivalente a 5% da população infectada por HBV. O diagnóstico pode ser realizado por métodos moleculares e sorológicos, mas que apresentam limitações, como por exemplo nos testes sorológicos realizados na fase crônica da infecção, onde o anticorpo e o antígeno para o HDV tornam-se um complexo, sendo necessário separá-los, dificulta o ensaio. Diante o exposto, o presente trabalho tem como objetivo padronizar e validar ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) para o diagnóstico da DC, baseado em um peptídeo triado anteriormente pelo grupo (TcPep), bem como triar por um peptídeo para o diagnóstico do HDV, que possa aumentar sensibilidade e especificidade dos testes, através de métodos computacionais. Portanto, para o estudo relacionado a DC otimizou-se diferentes etapas do ELISA como sensibilização, adsorção, tempo de incubação do anticorpo primário e secundário, bloqueio, concentrações de anticorpo primário e secundário e revelação. Por mim realizou-se dois ELISAs de

validação, um frente a soros de reação cruzada e outro frente a um número maior de soros de indivíduos infectados. Já para o estudo do HDV, a triagem de um novo peptídeo para compor um kit diagnóstico de ELISA para o HDV, foi realizada utilizando métodos computacionais como modelagem por homologia, dinâmica molecular e docking molecular, a fim de encontrar um epítopo promissor, que aumente a sensibilidade e especificidade do teste. Os resultados relacionados ao estudo do diagnóstico da DC apresentaram as melhores condições de cada etapa do ELISA otimizada que foi de 200 ng/poço de TcPep e placa SARSTEDT®, na etapa de sensibilização, tempos de incubação de 30 minutos tanto para anticorpo primário quanto para o secundário, tampão de adsorção carbonato-bicarbonato, bloqueio com PBST/leite em pó desnatado a 3% (200 µL/poço), anticorpo primário diluído 1:100 no tampão de bloqueio, anticorpo secundário diluído 1:10.000 e volume de 100

µL/poço de solução reveladora. No ELISA para validação final utilizou-se 102 soros de indivíduos portadores da DC na fase crônica e 27 soros de indivíduos saudáveis, obtendo uma sensibilidade de 95,2% e especificidade de 96,3%, demonstrando que o TcPep é promissor como biomarcador para o diagnóstico da DC. Para a triagem de um novo peptídeo promissor para o diagnóstico do HDV, analisou-se o alinhamento de 51 sequências do antígeno grande do HDV (L-HDAg) isolados do Brasil, em que apenas a sequência consenso foi selecionada (SEQ1). Em seguida, utilizou-se dois programas de modelagem por homologia, Swiss Model e I-TASSER, para criar o modelo da SEQ1. Os resultados demonstraram que o modelo do I-TASSER apresentou uma maior qualidade, já que seu C-score foi de -3,74. Posteriormente, realizou-se uma dinâmica molecular através do programa GROMACS, onde o modelo foi preparado. Os resultados demostraram estabilidade da proteína visto que os valores de RMSD, SASA e RG foram de 0,52nm, 147,76nm2 , 1,93nm, respectivamente. Em seguida os epítopos foram triados por três programas distintos, sendo eles BCpred, Discotope e o Ellipro, em que dois epítopos em comum nos três programas foi selecionado. A antigenicidade desses epítopos foi analisada pelo programa VaxiJen, em que

apenas um deles demonstrou ser antigênico. Por fim, realizou-se o docking molecular para ligar o epítopo ao anticorpo IgG, e analisar as regiões de interação. Ademais, foram realizadas mutações em diferentes resíduos para o aumento de afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Inicialmente, ocorreram 15 interações entre anticorpo e antígeno e após as mutações o número de interações aumentou para 54 interações, demonstrando assim que as mutações aumentaram a afinidade entre anticorpo e antígeno. Por fim, um novo alinhamento e similaridade foram realizados no BLASTp, em que o epítopo mutado foi similar apenas ao HDV como organismo patológico ao ser humano. Portanto, o peptídeo mutado apresenta um potencial para se ligar ao anticorpo IgG e detectá-lo em ELISA, mas ensaios in vitro devem ser realizados. Este estudo contribui para o desenvolvimento de kits de diagnósticos com antígenos nacionais promissores para o diagnóstico da doença de Chagas e hepatite delta.